پس از فارغ‌التحصیلی‌اش، به یک مقام ارزشمند در دانشگاه استراسبورگ تبدیل شد. او در سال ۱۸۵۴ میلادی کار خود را در مقام هیات علمی در دانشگاه شهر لیل قاطعانه دنبال کرد. فعالیت‌های پاستور در همین دانشگاه منجر به شهرت جهانی‌اش شد.پاستور در دانشگاه لیل روی فرآیند تخمیر مطالعه می‌کرد. در آن زمان به علت کمبود تجهیزات آزمایشگاهی از فرآیند تخمیر اطلاعات کمی در دست بود و پاستور حدس می‌زد علت این فرآیند پیچیده و مرموز باید  تحت تاثیر میکروارگانیسم‌های زنده باشد. پاستور ایده‌پرداز بسیار ماهری بود و ذهن خلاقش اغلب به نکاتی معطوف می‌شد که از چشم اکثر پژوهشگران به دور می‌ماند. در آن دوران اکثر دانشمندان و پژوهشگران اعتقاد داشتند فرآیند تخمیر به‌واسطه سلسله واکنش‌های شیمیایی صورت می‌گیرد که مسبب تمام این اتفاقات، آنزیم‌ها هستند. پاستور در سال ۱۸۵۷ میلادی به دانشگاه اکول نرمال بازگشت اما نه به‌عنوان یک استاد معمولی دانشگاه، بلکه به‌عنوان سرپرست مطالعات پژوهشی. او بالاخره این‌قدرت را پیدا کرد آزمایشگاهی مطابق میلش بنا کند تا فرضیه‌اش مبنی بر علت فرآیند تخمیر را به مرحله اثبات برساند. پاستور بالاخره در سال ۱۸۶۵میلادی موفق شد پتنت اختراع خودش را به ثبت جهانی برساند. در این زمان بود که رسما فرآیند پاستوریزاسیون کشف شد.

پاستور بالاخره موفق شد ثابت کند فرآیند تخمیر به علت فعالیت خود به خودی میکروارگانیسم‌ها رخ می‌دهد و ما به سادگی می‌توانیم با القای دمایی بین ۶۰ تا ۱۰۰ درجه سانتیگراد محصول موردنظر را از خطر تخمیر نجات دهیم. دانشمندان بعدها دریافتند می‌توان از این فرآیندی که پاستور اختراع کرده، برای پاستوریزه کردن محصولات لبنی مثل شیر نیز استفاده کرد.